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支原體(Mycoplasma)是最小▩•▩✘•、zui簡單的原核生物↟◕·。支原體有如下特徵▩•↟：支原體無細胞壁結構◕✘·▩₪，所以針對細胞壁的許多常見的抗生素◕✘·▩₪，如青黴su 或β-內醯胺類抗生素對支原體無效；支原體大小介於細菌和病毒之間◕✘·▩₪，約為0.2-0.8μm◕✘·▩₪，所以部分支原體可透過0.22μm濾器◕✘·▩₪，常規的過濾對支原體無效；很多支原體由於自身的生物合成能力有限而依靠宿主提供營養◕✘·▩₪，所以通常吸附或散落在細胞表面和細胞之間↟◕·。支原體的這些特徵使細胞培養過程中存在支原體汙染的風險◕✘·▩₪，細胞的支原體汙染已經成為一個世界性的普遍問題↟◕·。 支原體汙染可能會嚴重影響細胞的狀態◕✘·▩₪，使細胞的基因表達▩•▩✘•、代謝特徵發生變化◕✘·▩₪，導致細胞生長減緩▩•▩✘•、分化和死亡異常◕✘·▩₪，嚴重影響細胞功能↟◕·。這些影響因素會嚴重影響實驗結果的可靠性▩•▩✘•、可重複性和一致性◕✘·▩₪，因此支原體汙染的檢測非常重要↟◕·。細胞培養過程中的細菌▩•▩✘•、酵母或黴菌汙染在光學顯微鏡下可見◕✘·▩₪，但支原體汙染在光學顯微鏡下通常不可見◕✘·▩₪，必須透過特定的檢測方法進行檢測↟◕·。檢測支原體汙染的常用方法有支原體分離培養▩•▩✘•、ELISA▩•▩✘•、發光法等特殊的生化檢測以及DNA熒光染色檢測等↟◕·。上述檢測方法中◕✘·▩₪，大多操作步驟相對比較煩瑣▩•▩✘•、靈敏性不高▩•▩✘•、不能區分支原體種類▩•▩✘•、需要特殊儀器或所需時間較長↟◕·。而PCR法操作相對比較簡單便捷◕✘·▩₪，PCR擴增後透過電泳分析即可確定是否有支原體汙染◕✘·▩₪，並可根據擴增片段的大小大致預測至少11種所汙染的支原體種屬↟◕·。如果有必要◕✘·▩₪，也可以對PCR產物進行常規測序以確定具體的支原體種屬↟◕·。 支原體PCR檢測試劑盒是利用兩對引物透過巢式PCR法特異性擴增支原體基因組DNA段◕✘·▩₪，從而實現對支原體的高靈敏度特異性檢測的↟◕·。原核生物的rRNA鹼基序列非常保守◕✘·▩₪，而rRNA操縱子上編碼rRNA的DNA間隔區(space region)在各種生物種間的鹼基序列差別很大◕✘·▩₪，如16S和23S之間的間隔區↟◕·。這個間隔區的DNA序列及長度在支原體各個種屬間既有非常保守的部分◕✘·▩₪，也有較大差異的部分↟◕·。在編碼16S和23S的保守區DNA上設計一對F1/R1引物◕✘·▩₪，用於擴增16S和23S之間的間隔區◕✘·▩₪，這就是巢式PCR的第一輪PCR (1st PCR)◕✘·▩₪，用於初步鑑定是否有支原體汙染；然後在編碼16S和23S rRNA的DNA間隔區的保守區上設計一條F2引物◕✘·▩₪，在編碼23S rRNA的DNA上設計一條R2引物進行巢式PCR的第二輪PCR (2nd PCR)↟◕·。透過巢式PCR可以大大提高檢測的特異性和靈敏度↟◕·。
