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探究PCR引物的必要性


PCR引物的必要性│▩·☁:

1↟·││☁、 pcr技術的基本原理類似於dna的自然複製過程☁▩◕✘▩,其特異性依賴於靶序列兩端互補的寡核苷酸引物↟₪。

2↟·││☁、pcr是一種體外dna擴增技術☁▩◕✘▩,它依賴於dna聚合酶在模板dna↟·││☁、引物和四種脫氧核苷酸存在下的酶促反應↟₪。待擴增的DNA片段及其兩側互補的寡核苷酸鏈引物透過“高溫變性-低溫退火-引物延伸”三步反覆迴圈☁▩◕✘▩,使DNA片段的數量成倍增加☁▩◕✘▩,因此在短時間內☁▩◕✘▩,我們需要大量的特異性基因片段↟₪。

3↟·││☁、dna聚合酶無法從頭合成與模板鏈匹配的新鏈☁▩◕✘▩,只能在模板鏈上以一段短小(一般幾bp至十幾bp不等)但與模板鏈配對緊密的鏈作為起始鏈☁▩◕✘▩,沿5->3方向合成新鏈☁▩◕✘▩,這個過程我們稱之為“延伸”↟₪。

4↟·││☁、起始鏈的合成在真核細胞體內是由rna聚合酶(對就是轉錄時用的那個)代勞的☁▩◕✘▩,此酶具有從頭合成鏈的能力(即“起始”能力)之後dna合酶以這段短的rna鏈為起始☁▩◕✘▩,不斷延伸合成新鏈↟₪。這段短rna鏈起到了“引發”新鏈合成的功能☁▩◕✘▩,因此也被稱作“引物”↟₪。在原核生物中☁▩◕✘▩,dna分子以環狀形式存在☁▩◕✘▩,隨便切個口就可以以切口3端作為起始開始延伸了 (當然人家細菌還是有操守的☁▩◕✘▩,為了切得方便還是門設定了一個複製起始位點)↟₪。

5↟·││☁、在dna新鏈延伸完畢後☁▩◕✘▩,真核細胞需要將作為起始鏈的rna鏈替換為dna☁▩◕✘▩,這個過程依據位置不同在細胞裡大致有兩種處理方式│▩·☁:如果引物在dna鏈一端☁▩◕✘▩,別說了直接上端粒合酶吧;若引物位於dna鏈中間☁▩◕✘▩,則是由同樣具有dna延伸活性(但速度比述的dna合酶慢許多)併兼具5->3方向水解能力(這樣才能把引物rna鏈切掉)的另一種dna合酶代勞☁▩◕✘▩,後用dna連線酶將替換鏈和新鏈之間的小缺口填補上↟₪。原核生物等低等生物中由於有滾環複製θ複製等特殊機制存在☁▩◕✘▩,複製流程的細節上會有差異☁▩◕✘▩,並且會多一步切割並環化dna分子的步驟☁▩◕✘▩,不過總體機制大同小異↟₪。

可見☁▩◕✘▩,在生物體內的dna複製過程是複雜的☁▩◕✘▩,需要多種酶先後參與進來☁▩◕✘▩,並且對於dna的延伸來說☁▩◕✘▩,引物是必不可少的↟₪。

6↟·││☁、在體外的pcr體系中☁▩◕✘▩,由於│▩·☁:

①出於成本考量☁▩◕✘▩,暫時沒有發現並最佳化在pcr工作溫度(55°C--95°C+)下仍具有很好活性的rna合酶↟·││☁、dna合酶(替換引物用)↟·││☁、dna連結酶↟₪。

②出於現有工藝考量☁▩◕✘▩,從頭合成設計好的dna短引物是相對簡單快捷的技術☁▩◕✘▩,並且可以省略引物的替換步驟↟₪。

因此使用短dna作為引物是必要且高效的選擇↟₪。

 

 

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